A375人恶性黑色素瘤细胞

到货处理

1 T25瓶形式

（1）收到T25瓶细胞货物后，打开外包装，取出T25瓶细胞；

（2）使用75%酒精对T25瓶外表面进行喷雾消毒处理，擦拭干净后，放置细胞培养箱，静置2小时以上；

（3）取出T25瓶，在倒置显微镜下观察细胞状态，并拍照记录，100倍，1张清晰照片即可；

（4）若细胞正常贴壁且细胞密度低于80%时，在生物安全柜中，进行细胞换液处理，即将T25瓶中培养上清全部丢弃，加入5mL细胞完培，然后放置细胞培养箱中培养；

（5）若细胞正常贴壁且细胞密度高于80%时，在生物安全柜中，进行细胞传代处理，详见“细胞传代”操作，将传代后的2个T25瓶放置细胞培养箱中培养；

（6）若细胞出现漂浮，在生物安全柜中，请将T25瓶中漂浮的细胞及瓶底细胞全部收集到50mL离心管中，离心收集细胞沉淀，加入1mL胰酶溶液消化细胞沉淀，再加入2mL细胞完培终止消化，离心收集细胞后，加入1mL细胞完培重悬，将细胞悬液重新接种到T25瓶中。

2 冻存管形式

（1）收到冻存管货物后，打开外包装，取出细胞冻存管，如暂时不用，请立即放置-80℃冰箱或液氮罐中暂存，建议暂存时间不要超过3天；

（2）取出细胞冻存管，立即进行细胞复苏，详见“细胞复苏”操作，1支冻存管建议接种到1个T25瓶中，另1支细胞冻存管备用。

质量控制

细胞培养

1 细胞复苏

（1）提前15分钟打开水浴锅设备，设置温度为37℃；

（2）从-80℃冰箱或液氮罐中取出1支细胞冻存管；

（3）将冻存管立即放置在水浴中，不断摇晃冻存管，使其在2分钟内解冻；

（4）在生物安全柜中，将冻存管中细胞悬液转移到15mL离心管中，加入4mL细胞完培；

（5）配平，室温离心，1000rpm离心5分钟；

（6）在生物安全柜中，弃去上清液，加入1mL细胞完培重悬细胞沉淀，将细胞悬液全部转移到T25瓶中，补加4mL细胞完培；

（7）将T25瓶放置细胞培养箱中培养；

（8）第二天在倒置显微镜下观察细胞状态，并更换新鲜细胞完培。

2 细胞传代

（1）当T25瓶细胞密度达到80%以上时，在生物安全柜中，弃去培养上清；

（2）加入2mL PBS润洗细胞，弃去PBS；

（3）加入2mL胰酶溶液（0.25%Trypsin-0.02%EDTA）浸润细胞，放置细胞培养箱处理1～3分钟，待细胞从瓶皿完全脱落后，加入3mL细胞完培终止消化，将细胞悬液转移到15mL离心管中；

（4）配平，室温离心，1000rpm离心5分钟；

（5）在生物安全柜中，弃去上清液，加入1mL细胞完培重悬细胞沉淀，将细胞悬液平均分装到2个新的T25瓶中，每个T25瓶分别补加4mL细胞完培，混合均匀；

（7）将T25瓶放置细胞培养箱中培养。

3 细胞冻存

（1）当T25瓶细胞密度达到80%以上时，在生物安全柜中，弃去培养上清；

（2）加入2mL PBS润洗细胞，弃去PBS；

（3）加入2mL胰酶溶液（0.25%Trypsin-0.02%EDTA）浸润细胞，放置细胞培养箱处理1～3分钟，待细胞从瓶皿完全脱落后，加入3mL细胞完培终止消化，吹打均匀后，取50uL细胞悬液进行计数，剩余细胞悬液转移到15mL离心管中；

（4）配平，室温离心，1000rpm离心5分钟；

（5）在生物安全柜中，弃去上清液，根据细胞数量加入适量细胞冻存液重悬细胞沉淀，细胞冻存密度为1×10E6～5×10E6/mL，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，在冻存管壁做好标识；

（6）将冻存管放入-80℃冰箱，24小时后转入液氮罐中长期储存。