「 技术交流 」高通量测序相关检测准备方法及要求

1、样本量要求：

RNA类文库组织样品量要求
送样原则：新鲜、幼嫩、干净、足量
物种	项目类型	最低样品量	建议提供样品量
细菌菌体	转录组测序	菌体湿重0.1g	菌体湿重0.3g
动植物组织	转录组测序	组织鲜重0.2g，只记有效组织细胞重量	组织鲜重0.6g，只记有效组织细胞重量
	SmallRNA测序	组织鲜重0.2g，只记有效组织细胞重量	组织鲜重0.6g，只记有效组织细胞重量
	LncRNA测序	组织鲜重0.4g，只记有效组织细胞重量	组织鲜重1.2g，只记有效组织细胞重量
	CircRNA测序	组织鲜重1g，只记有效组织细胞重量	组织鲜重3g，只记有效组织细胞重量
	全转录组	组织鲜重0.6g，只记有效组织细胞重量	组织鲜重1.8g，只记有效组织细胞重量
	全长转录组	组织鲜重2g，只记有效组织细胞重量	组织鲜重6g，只记有效组织细胞重量
真菌	转录组测序	菌体、菌丝、孢子粉等湿重0.2g	菌体、菌丝、孢子粉等湿重0.6g
	SmallRNA测序	菌体、菌丝、孢子粉等湿重0.2g	菌体、菌丝、孢子粉等湿重0.6g
	LncRNA测序	菌体、菌丝、孢子粉等湿重0.4g	菌体、菌丝、孢子粉等湿重1.2g
	CircRNA测序	菌体、菌丝、孢子粉等湿重1g	菌体、菌丝、孢子粉等湿重3g
	全转录组	菌体、菌丝、孢子粉等湿重0.6g	菌体、菌丝、孢子粉等湿重1.8g
	全长转录组	菌体、菌丝、孢子粉等湿重2g	菌体、菌丝、孢子粉等湿重6g
动植物和酵母细胞	转录组测序	5×106	2×107
	SmallRNA测序	5×106	2×107
	LncRNA测序	1×107	3×107
	CircRNA测序	2×107	6×107
	全转录组	2×107	6×107
	全长转录组	5×107	2×108
土壤、污泥等	宏转录组测序	0.5g	1.5g
新鲜血液（抗凝）	转录组测序	0.25ml	0.75ml
	SmallRNA测序	0.25ml	0.75ml
	LncRNA测序	0.5ml	1.5ml
	CircRNA测序	1.25ml	3.75ml
	全转录组	0.75ml	2.25ml
	全长转录组	2.5ml	7.5ml
血浆、血清	SmallRNA测序	0.25ml	0.75ml

扩增子类文库原样样品量要求
送样原则：新鲜、幼嫩、干净、足量、安全
种类	最少送样量	建议送样量
粪便	鲜重0.5-1g	鲜重1.5-3g
肠道内容物	鲜重0.5-1g	鲜重1.5-3g
肠道组织	鲜重0.3g	鲜重0.9g
唾液样本	1-2ml	2-4ml
生殖道样本	刮片1片	刮片3片
	棉拭子1份	棉拭子3份
固体类食品	20g	60g
液体类食品	10ml	50ml
土壤	鲜重0.5-2g	鲜重2-5g
植物内生菌	≥10个贴片、卷片组织	≥20个贴片、卷片组织
	≥0.5g石蜡块	≥1.5g石蜡块
水样滤膜	直径3-5cm，1张	直径3-5cm，3-5张
DNA类文库组织样品量要求
送样原则：新鲜、幼嫩、干净、足量、安全
种类	最少送样量	建议送样量
菌类	菌体湿重0.1g	菌体湿重0.3g
植物组织	嫩叶鲜重1g	嫩叶鲜重0.6g
动物组织	肌肉组织鲜重0.3g	肌肉组织鲜重0.6g
昆虫	正常体型（组织）0.2-0.3g	正常体型（组织）0.6-0.9g
	微体型0.3g以上	微体型0.9g以上
血液（抗凝）	哺乳动物血液1ml	哺乳动物血液3ml
	非哺乳动物血液0.5ml	非哺乳动物血液1.5ml
其他（土壤、粪便等）	鲜重0.5-1g	鲜重2-4g
FFPE样本	≥10个贴片、卷片组织	≥20个贴片、卷片组织
	≥0.5g石蜡块	≥1.5g石蜡块
水样滤膜	直径3-5cm，1张	直径3-5cm，3-5张

2、转录组测序样品制备要求：

本次总结了用于不同 RNA 类型测序以及不同来源样品的制备过程与送样要求，供科研工作者参考。

样本采集前注意事项 

1、取样的代表性 

为保证科研人员所得到实验最终结果具有科学意义，所采集的样本应该通过严格的细胞学、组织学、病理学等相关鉴定。

2、取样的准确性 

组织取材部位要准确（尤其是互作转录组），正确识别所要研究的组织部位，剔除与研究无关的组织部位，在条件允许的前提下，争取做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面可能保持一致。

3、取样的严谨性 

所有取样环节的步骤一定要严格按照操作步骤进行，并且尽量在短时间内完成，否则极易造成 RNA 的降解。

4、取样的无污染性 

所用实验器械、容器需经去 RNA 酶处理，处理样本的试剂需用 RNasefree 水配制。

5、取样的安全性 

考虑到实验人员的安全问题，不接收病毒类相关项目（包括病毒原液、RNA）。

 

 

第一节 动物组织样本准备流程 

实验目的：取动物特定组织开展 RNA 测序。

样本要求：动物活体

实验准备：

1. 无水乙醇（分析纯和优级纯均可）500ml； 

2. DEPC 水（0.1% DEPC），500ml，可用焦炭酸二乙酯（DEPC）和超纯水按照 1:1000 配制，并高温高压灭菌 30min，也可购买商品化的 DEPC 水，如 Sigma、Amresco 等；

3. RNAzap（AmbionRNaseZap® RNase Decontamination Solution， AM9780），主要用来擦拭操作台面，取样工具；

4. 无 RNase 的解剖剪、镊子、刀片（可用酒精棉擦净后锡纸包好，180℃ 烘箱 4 小时进行处理）；

5. 液氮 3L； 

6. 干冰 10-15kg（也可取样液氮冷冻后放置在 -80℃ 冰箱，样本寄送时再订购干冰）；

7. 商品化无 RNase 的离心管，如 Eppendorf、Extragene 等；

8. 一次性口罩，一次性手套，橡胶手套，锡箔纸，超纯水，酒精棉，无纺布，自封袋，100ml 烧杯。

实验前处理：

1. 实验前用酒精棉擦拭工作台面，用无纺布蘸 RNAzap 擦一遍；

2. 锡箔纸铺台面，用酒精棉擦拭锡箔纸，后续操作在锡箔纸铺的台面上进行；

3. 将所有用到的烧杯内外表面、锡箔纸表面、镊子、解剖剪、刀片用无水乙醇擦一遍，再用无纺布蘸 RNAzap 擦一遍；

4. 实验全程佩戴一次性口罩；

5. 实验全程佩戴橡胶手套，并勤换手套。

实验操作：

1. 烧杯倒入 50ml DEPC 水（DEPC 水要勤换，每解剖一个生物学样本换一次）。

2. 解剖活体特定组织样本，在有 DEPC 水的烧杯中涮干净表面血液（动作一定要快，几秒内完成），放入无 RNase 离心管中，拧紧盖子，放入液氮中冷冻 10 分钟，取出离心管放入自封袋，并放入 -80℃ 冰箱等待寄送。

注意事项：

1. 实验过程中，烧杯内壁、解剖剪、镊子、刀片勤用 RNAzap 擦，离心管和自封袋用前做好标记，所有操作动作一定要快；

2. 液氮可倒在冰盒里，将装好样本的离心管放入冰盒中速冻； 

3. 禁止寄送用裂解液保存的组织样本，因为实验中发现，用裂解液保存的组织样本，无论是研磨好的粉末还是切割好的组织块，所抽提的 RNA 质量普遍存在不同程度的降解；

4. 动物及临床组织禁止使用锡箔纸、自封袋包裹，严格按照取样要求使用螺纹冻存管保存组织，锡箔纸、自封袋容易与动物及临床组织粘一起，RNA 抽提的过程容易带入锡箔纸、自封袋，引起污染，且取样时间过长也会增大 RNA 降解的风险；

5. 禁止使用标签纸进行样品标记，标签纸经液氮冷冻过后易脱落，造成样品混乱；

6. 从样本提取到送样，最好不要超过 3 个月；

7. 送样前切忌反复冻融，否则易造成 RNA 降解；

8. 该送样要求适用于多数 RNA 丰度较高的组织，针对丰度较低的组织需要加大送样量，具体组织 RNA 丰度见下表：

高丰度	中丰度	低丰度
肝脏、胰腺、脾脏、肾脏	脑、肺、心脏	皮肤、骨、脂肪

9. 在没有液氮速冻组织的情况下，可适当选择使用 RNAlater（Ambion, AM7020）及类似保存液保存的样本，严格按照操作说明进行，组织块需切成长宽高为0.1cm 的小块，浸没于 5 倍体积的 RNAlater 溶液中，4°C 浸泡过夜，然后保存于-80°C 冰箱，干冰运输。详细操作流程请参阅 RNAlater 说明书。组织块切勿过大，过大会影响 RNAlater 渗透入组织内部的效率，同时也会造成 RNAlater 无法完全覆盖组织，而未被 RNAlater 覆盖的组织部位极易被RNase 降解；

 

RNAlater 使用注意事项： 

1. RNAlater 平时室温存放，如产生沉淀，可 37℃ 水浴加热溶解沉淀，沉淀溶解后可继续使用。

（2）仅适用于新鲜组织样本，不适用已冷冻保存的组织样本，骨头及表皮蜡质丰富的植物同样也不适用。

（3）可保存绝大多数组织样本，不建议用 RNAlater 保存液体样本（RNAlater 会与液体样本发生互溶）。

（4）RNAlater 保存样本时，不要立即冷冻，需 4℃ 保存过夜后，再转到 -20℃ 或 -80℃（梯度降温），使得 RNAlater 充分浸润样本。

（5）采集样本时，在没有冰箱的情况下，可以先把保存于 RNAlater 的样品暂时置于冰上。

 

第二节 动物贴壁细胞准备流程 

实验目的：取动物细胞开展 RNA 测序。

样本要求：新鲜培养的细胞样品。

实验准备：

1. 无水乙醇（分析纯和优级纯均可）和酒精棉； 

2. RNAzap（Ambion RNaseZap® RNase Decontamination Solution，AM9780）；

3. 预冷的 1xPBS（DEPC 水配置）；

4. Trizol 裂解液；

5. 无 RNase 的细胞冻存管、玻璃吸管，酒精灯；

6. 干冰 10-15kg（可先放置在 -80℃ 冰箱，样本寄送时再订购干冰）和液氮；

7. 商品化无 RNase 的冻存管，如 Eppendorf、Extragene 等；

8. 一次性口罩，一次性手套，橡胶手套，自封袋。 

实验前处理：

1. 实验前用酒精棉擦拭工作台面，用无纺布蘸 RNAzap 擦一遍；

2. 实验全程佩戴一次性口罩；

3. 实验全程佩戴橡胶手套，并勤换手套。

实验操作：

1. 将培养的细胞培养瓶 / 培养皿从培养箱中取出，观察细胞密度和细胞状态，确认细胞的状态良好及其完整性（破裂的细胞会释放出 RNA 酶降解RNA）。

2. 用电动移液器移去培养瓶 / 培养皿中细胞培养基。 

3. 将培养瓶 / 培养皿倾斜，在培养瓶底部 / 培养皿侧壁缓慢加入适量（3ml

左右）预冷 PBS，放平培养瓶 / 培养皿，轻轻前后晃动培养瓶，清洗细胞数秒，

然后弃去 PBS，重复此步骤两次。

4. 经过预冷的 1×PBS（DEPC 水配置）洗涤的细胞极易脱落，根据细胞培养瓶中数目加入适量 Trizol，轻轻吹打混匀使细胞充分裂解。保证 1ml Trizol 中有大约 5×106 细胞，细胞密度不可过高，否则 Trizol 裂解液效果不好， RNA易降解。

5. 将吹打混匀后的细胞和裂解液混合物取 1ml 转移至 1.5ml 无酶冻存管中，液氮速冻，-80℃ 保存，每个样品准备 3 管，作为三次提取的量，此步骤切不可将 1.5×107 个细胞全部保存在 1ml 的 Trizol 中，否则 Trizol 无法起到裂

解细胞保护 RNA 的作用，造成 RNA 降解。

注意事项：

（1）细胞必须裂解充分后再寄送，勿将干冻的细胞直接寄送，因为细胞冷冻的过程中冰晶很容易刺破细胞，此时破碎的细胞会释放内源性 RNase，从而降解 RNA。

（2）细胞裂解是否充分很关键，细胞裂解充分的标志：细胞与裂解液的混合物形成清亮不粘稠的液体，且没有细胞团块残留，如果细胞样品始终粘度很大，说明该细胞样品仍未裂解充分，此时应继续补加裂解液，以 100μl 为梯度进行补加，直到样品裂解充分。

（3）细胞样品尽量勿用胰酶消化，胰酶会消化细胞膜上的膜蛋白，导致细胞破裂，破裂的细胞会释放 RNase 导致 RNA 降解。

（4）如果培养基中细胞碎片较多，培养基中杂质较多，可以在清洗后使用 PBS 收集细胞，然后 1000rpm 离心 3min，弃去上清液，使用 Trizol 按照 5×106 密度进行重悬和液氮速冻。

（5）如果对于细胞数目不好把握，可以使用细胞计数板进行计数后添加Trizol。

（6）收集原则是收集完整细胞，无杂质，减少操作步骤，操作尽量轻柔，以及 Trizol 重悬密度要合适。

 

第三节 动物悬浮细胞准备流程 

实验目的：取动物细胞开展 RNA 测序。

样本要求：新鲜培养的细胞样品。

实验准备：

1. 无水乙醇（分析纯和优级纯均可）和酒精棉； 

2. RNAzap（Ambion RNaseZap® RNase Decontamination Solution，AM9780）；

3. 预冷的 1xPBS（DEPC 水配置）；

4. Trizol 裂解液；

5. 无 RNase 的细胞冻存管、玻璃吸管，酒精灯；

6. 干冰10-15kg（可先放置在-80℃冰箱，样本寄送时再订购干冰）和液氮；

7. 商品化无 RNase 的冻存管，如 Eppendorf、Extragene 等；

8. 一次性口罩，一次性手套，橡胶手套，自封袋。 

实验前处理：

1. 实验前用酒精棉擦拭工作台面，用无纺布蘸 RNAzap 擦一遍；

2. 实验全程佩戴一次性口罩；

3. 实验全程佩戴橡胶手套，并勤换手套。

实验操作：

1. 将培养的细胞培养瓶 / 培养皿从培养箱中取出，观察细胞密度和细胞状态，确认细胞的状态良好及其完整性（破裂的细胞会释放出 RNsea 酶降解RNA）；

2. 用电动移液器吸取培养瓶 / 培养皿中细胞及培养基混合物，转移至离心管中，200g，离心 5min；

3. 弃去上清液，加入适量 1xPBS（DEPC 水配置），轻轻重悬细胞，然后 200g，离心 5min，去上清，重复此步骤两次；

4. 根据细胞数目加入适量 Trizol，轻轻吹打混匀使细胞充分裂解。保证1ml Trizol 中有大约 5×106 细胞，细胞密度不可过高，否则 Trizol 裂解液效果不好，RNA 易降解；

5. 将吹打混匀后的细胞和裂解液混合物取 1ml 转移至 1.5ml 无酶冻存管中，液氮速冻，-80℃ 保存，每个样品准备 3 管，作为三次提取的量，此步骤切不可将 1.5×107 个细胞全部保存在 1ml 的 Trizol 中，否则 Trizol 无法起到裂解细胞保护 RNA 的作用，造成 RNA 降解。

 

注意事项：

（1）细胞必须裂解充分后再寄送，勿将干冻的细胞直接寄送，因为细胞冷冻的过程中冰晶很容易刺破细胞，此时破碎的细胞会释放内源性 RNase，从而降解 RNA。

（2）细胞裂解是否充分很关键，细胞裂解充分的标志：细胞与裂解液的混合物形成清亮不粘稠的液体，且没有细胞团块残留，如果细胞样品始终粘度很大，说明该细胞样品仍未裂解充分，此时应继续补加裂解液，以 100μl 为梯度进行补加，直到样品完全裂解充分。

（3）如果培养基中细胞碎片较多，培养基中杂质较多，可以在清洗后使用 PBS 收集细胞，然后 1000rpm 离心 3min，弃去上清液，使用 Trizol 按照5×106 密度进行重悬和液氮速冻。

（4）如果对于细胞数目不好把握，可以使用细胞计数板进行计数后添加Trizol。

（5）收集原则是收集完整细胞，无杂质，减少操作步骤，操作尽量轻柔，以及 Trizol 重悬密度要合适。

 

第四节 动物血液样本准备流程 

实验目的：取动物全血 / 血清 / 血浆开展 RNA 测序。

样本要求：动物活体。

实验准备：

1. 无 RNase 的 解 剖 剪、 镊 子、 刀 片， 先 用 酒 精 擦 拭 一 遍， 然 后 用RNAzap（Ambion RNaseZap® RNase Decontamination Solution，AM978）擦拭一次，最后用酒精棉擦净后锡纸包好，180℃ 烘箱 4 小时进行处理；如用注射器取大型动物血液，以上材料可不用准备，但需保证注射器需无菌；

2. 液氮 3L，酒精棉，冰盒； 

3. 干冰 10-15kg（也可取样液氮冷冻后放置在 -80℃ 冰箱，样本寄送时再订购干冰）；

4. 商品化 EDTA 的抗凝管（盖子颜色为紫色，抗凝剂也可为柠檬酸钠）；

5. 商品化 1.5ml 无 RNase 离心管，如 eppendorf、Axygen 等；

6. 规格为 1ml 的移液器，1ml 无 RNase 枪头，eppendorf、Axygen 等；

7. 一次性口罩，一次性手套，乳胶手套，自封袋； 

8. RNAzap（Ambion RNaseZap® RNase Decontamination Solution，AM978）；

9. Trizol LS（Ambion，10296010，Trizol® LS Reagent）；

10. 蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS，GE Healthcare Life Sciences #17-1440- 02）；

11. 冷冻离心机。

 

实验前处理：

1. 实验台用酒精擦拭一次，随后用 RNAzap 擦拭一次；

2. 移液器等所用到的实验耗材均用酒精棉擦拭，之后再用 RNAzap 擦拭一次；

3. 实验全程佩戴一次性口罩； 

4. 实验全程佩戴乳胶手套，并勤换手套，每戴一次新手套，用酒精棉擦拭一次后，再用 RNAzap 擦拭一次。

实验操作：

全血（不分哺乳与非哺乳）：

送样量：动物血液 ≥2 ml；动物血液（红细胞有核类）≥1 ml

1. Trizol 法样品制备（总 RNA） 

（1）取 15ml 管 1 个，加入 6 ml Trizol LS 和 2 ml 新鲜血液（Trizol LS：血液 = 3：1），用移液器吹打几次以帮助裂解样品中的细胞；

（2）样品剧烈震荡混匀 1~2 min，直到絮状物全部溶解；

（3）室温孵育 5 min 以使核蛋白体完全分解；

（4）写好编号，封口膜封存并立即放入液氮中速冻，-80 ℃冻存，干冰寄送。

注意： 新鲜血液务必在 2 小时内加入 Trizol LS 处理，否则会出现不同程度降解；冰冻血液溶解过程中会有破碎的细胞释放 RNase 酶，因此建议在冰冻前加入 Trizol LS， 切勿直接冻存新鲜血液，保存好的血液应避免反复冻融。

2. BD PAXgene Blood RNA Tube 法样品制备（总 RNA，适用人和灵长类动物）

采集血样

产品名称：BD 762165 PAXgene Blood RNA Tube；QIAGEN

中文名称：BD 静脉真空采血管；全血 RNA 管

参考产品说明书直接进行采样，该 BD 采血管中添加了特殊的试剂，可以快速地保护细胞内的 RNA 不被降解，在 18 ～ 25℃ 可以保存 3 天，2 ～ 8℃可以保存 5 天，在 -20°C 或 -70°C 条件下至少稳定 50 个月。

备注：人血液样本推荐使用 PAXgene 法，操作更简便，提取的 RNA 质量也更高。

血细胞分离

1. 非哺乳动物：成熟的红细胞为有核细胞，所以直接收集血细胞即可，

收集步骤为：

将全血 10-15ml 加入到 50ml 离心管中，离心 3000rpm，10min，取下层细胞沉淀， 加入 1ml Trizol 混匀，转移至 1.5ml 离心管中，液氮速冻 15 分钟，-80℃ 保存。

2. 哺乳动物：由于成熟的红细胞无核，所以收集的为外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。收集步骤为：

（1）将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；

（2）取两支 15ml 离心管，分别先加入 5ml Ficoll 溶液（蔗糖溶液，Ficoll Pague PLUS，GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02 ），然后将稀释的血液（每只离心管各 10ml 稀释血液）轻轻加到两支离心管的 Ficoll 上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起；

（3）2000rpm，20min，需要注意的是，降速设置中一定要设置成 no break，或者将升降速调制最小。离心完毕将得到如图所示分层：

（4）PBMC 所在细胞层为白膜层。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的 15ml 离心管中；

（5）加入 PBS 至 10-15ml，1,500rpm，10min 离心后去掉上清，加入1ml Trizol 混匀，转移至 1.5ml 离心管中，液氮速冻 15 分钟，-80℃ 保存。

血浆：将抗凝管收集的全血 10ml 加入到 50ml 离 心 管 中， 离 心 3000rpm， 10min，取上层血浆，分装入 1.5ml 的离心管中，每管 1ml，至少分装 3 管， 液氮速冻 15 分钟，-80℃ 保存。

血清：收集全血时不加抗凝剂，全血 10ml 加入到 50ml 离心管中，凝血后，离心 3000rpm，10min，分离所得的血清样本分装入 1.5ml 的离心管中，每管1ml，至少分装 3 管，液氮速冻 15min，-80℃ 保存。

注意事项：

1. 抗凝剂选择 EDTA 或者柠檬酸钠，不要选择肝素，因为肝素会抑制后续建库聚合酶的活性。

（2）因为血液 RNA 含量比较低，且杂质很多，请每个样品必须送三管。

（3）血液里面成分太复杂，即使冻存在 -80℃ 冰箱，细胞也会裂解，造成 RNA 降解，所以血液保存有三种方式：1）新鲜血液，2-8℃ 放置时间不要超过 2 小时，2 小时后 mRNA 会开始降解；2）分离血细胞，这种方式最为推荐，血细胞数一次提取需 10 的 6-7 次方；3）冻存在 Trizol LS 里，但保存时间最长不要超过一个月，时间越长降解的风险越大。

（4）冰冻血液溶解过程中会有破碎的细胞释放 RNase 酶，因此建议在冰冻前加入 Trizol， 切勿直接冻存新鲜血液，保存好的血液应避免反复冻融。如果按照 PBMC 方法提取，在保证所有用到的试剂无 RNase 之外，不要在PBMC 后加入任何冻存液。

（5）实验过程中，离心管和自封袋用前做好标记，所有操作动作一定要快。

（6）液氮可倒在冰盒里，将装好样本的离心管放入冰盒中速冻。

（7）从样本提取到送样，最好不要超过 15 天。

（8）送样前切忌反复冻融。

 

第五节 真菌样本准备流程 

实验目的：对真菌开展 RNA 测序。

样本要求：新鲜、对数期培养的真菌

实验准备：

1. 无水乙醇（分析纯和优级纯均可）500ml；酒精灯（用于固体培养基取样过程）；

2. RNAzap（AmbionRNaseZap® RNase Decontamination Solution，AM9780）；

3. 无 RNase 的镊子、长柄刀片（用于固体培养基取样过程），可用酒精棉擦净后锡纸包好，180℃ 烘箱 4 小时进行处理；灭菌后无 RNase 的枪头（用于液体培养基取样过程）；

4. 液氮 3L； 

5. 干冰 10-15kg（也可取样液氮冷冻后放置在 -80℃ 冰箱，样本寄送时再订购干冰）；

6. 商品化无 RNase 的离心管，如 Eppendorf、Extragene 等；

7. 一次性口罩，一次性手套，橡胶手套，超纯水，酒精棉，无纺布，自封袋。

实验前处理：

1. 取样须在无污染的超净工作台进行（空气中游离孢子可能造成菌的污染），实验前开紫外灯灭菌 15 分钟，且用酒精棉擦拭超净工作台面；

2. 将所有用到的用具表面、镊子、刀片用无水乙醇擦一遍，再用无纺布蘸RNAzap 擦一遍；

3. 实验全程佩戴一次性口罩；

4. 实验全程佩戴橡胶手套，并勤换手套。

实验操作：

固体培养基培养

1. 在菌体生长最旺盛的对数期取样，打开培养皿盖后，培养皿正面倾斜向下，注意手臂尽量不要从培养皿上方经过；

2. 将灭菌后的无 RNase 长柄刀片在酒精灯火焰上过几遍，冷却后用无RNAase 的长柄刀片轻轻刮下菌体，注意不要刮到培养基；

3. 将收集的菌体放入 1.5ml 无酶离心管中，注意离心管放平，避免管口朝上；

4. 将盛菌体的无酶离心管迅速置于液氮中冷冻 15 分钟，冷冻完成后，放入自封袋于 -80℃ 保存，等待寄送（勿使用 PBS 清洗）；请务必收集生长旺盛时期的菌体，并保证无培养基残留，菌体过老或培养基残留会严重影响后续的提取结果。

液体培养基培养

1. 用无 RNase 的枪头吸取 1ml 对数期（OD600=0.5-0.8）的菌悬液于 1.5ml无酶管中；

2. 离心。4℃，10000rpm，2min，充分去除上清；

3. 再加入 1ml 对数期菌悬液，重复离心操作，并充分去除上清（即总共取菌液 2ml）；

4. 将放菌体的无酶离心管迅速置于液氮中冷冻15分钟，冷冻完成后-80℃保存，等待寄送（勿使用 PBS 清洗）；请务必收集对数期菌体，并尽可能的吸净培养基，菌体过老或培养基残留会严重影响后续的提取结果。

注意事项：

（1）菌菇等植物型真菌取样要求参照植物样本准备流程。 

（2）一定要保证菌体的培养以及取样环境的纯净，空气中孢子都有可能引起菌体的污染。培养基成分来源需干净无污染，并且进行严格的灭菌操作。

（3）一定要取对数期的菌体，菌体过老或死亡会产生次生代杂质，RNA降解等现象，严重影响 RNA 的提取质量。

（4）注意处理条件以及添加的培养基成分是否会影响菌的正在生长，菌体生长异常难提取出质量合格的 RNA。

（5）菌体不能用 RNAlater 保存，因为细菌真菌细胞壁较厚，RNAlater不易渗透，会造成降解。

 

第六节 细菌样本准备流程 

实验目的：对细菌开展 RNA 测序。

样本要求：新鲜、对数期培养的细菌

实验准备：

1. 无水乙醇（分析纯和优级纯均可）500ml；酒精灯（用于固体培养基取样过程）；

2. RNAzap（AmbionRNaseZap® RNase Decontamination Solution，AM9780）；

3. 无 RNase 的镊子、长柄刀片（用于固体培养基取样过程），可用酒精棉擦净后锡纸包好，180℃ 烘箱 4 小时进行处理。灭菌无 RNase 的枪头（用于液体培养基取样过程）；

4. 液氮 3L； 

5. 干冰 10-15kg（也可取样液氮冷冻后放置在 -80℃ 冰箱，样本寄送时再订购干冰）；

6. 商品化无 RNase 的离心管，如 Eppendorf、Extragene 等；

7. 一次性口罩，一次性手套，橡胶手套，超纯水，酒精棉，无纺布，自封袋。

实验前处理：

1. 取样须在无污染的超净工作台进行（空气中游离孢子可能造成菌的污染），实验前开紫外灯灭菌 15min，且用酒精棉擦拭超净工作台面；

2. 将所有用到的用具表面、镊子、刀片用无水乙醇擦一遍，再用无纺布蘸 RNAzap 擦一遍；

3. 实验全程佩戴一次性口罩；

4. 实验全程佩戴橡胶手套，并勤换手套。

实验操作：

固体培养基培养

1. 在菌体生长最旺盛的对数期取样，打开培养皿盖后，培养皿正面倾斜向下，注意手臂尽量不要从培养皿上方经过；

2. 将灭过菌的无 RNase 长柄刀片在酒精灯火焰上过几遍，冷却后用无RNAase 的长柄刀片轻轻刮下菌体，注意不要刮到培养基；

3. 将收集的菌体放入 1.5ml 无酶离心管中，注意离心管放平，避免管口朝上；

4. 将放菌体的无酶离心管迅速置于液氮中冷冻 15min，冷冻完成后，放入自封袋于 -80℃ 保存，等待寄送（勿使用 PBS 清洗）；请务必收集生长旺盛时期的菌体，并保证无培养基残留，菌体过老或培养基残留会严重影响后续的提取结果。

液体培养基培养

1. 用无 RNase 的枪头吸取 1ml 对数期（OD600=0.5-0.8）的菌悬液于 1.5ml无酶管中；

2. 离心，4℃，10000rpm，2min，充分去除上清；

3. 再加入 1ml 对数期菌悬液，重复离心操作，并充分去除上清（即总共取菌液 2ml）；

4. 将盛菌体的无酶离心管迅速置于液氮中冷冻15分钟，冷冻完成后-80℃保存，等待寄送（勿使用 PBS 清洗）；请务必收集对数期菌体，并尽可能的吸净培养基，菌体过老或培养基残

留会严重影响后续的提取结果。

注意事项：

（1）一定要保证菌体的培养以及取样环境的纯净，空气中孢子都有可能引起菌体的污染。培养基成分来源需干净无污染，并且进行严格的灭菌操作。

（2）一定要取对数期的菌体，菌体过老或死亡会产生次生代杂质，RNA降解等现象，严重影响 RNA 的提取质量。

（3）注意处理条件以及添加的培养基成分是否会影响菌的正在生长，菌体生长异常难提取出质量合格的 RNA。

（4）菌体不能用 RNAlater 保存，因为细菌真菌细胞壁较厚，RNAlater不易渗透，会造成降解。

 

 

 

第七节 植物组织样本准备流程 

实验目的：取植物特定组织开展 RNA 测序。

样本要求：植物活体。

实验前准备：

1. 无水乙醇（分析纯和优级纯均可）500ml； 

2. DEPC（焦炭酸二乙酯）水（0.1% DEPC），500ml，可用 DEPC 和超纯水按照 1:1000 配制，并高温高压灭菌 30min，也可购买商品化的 DEPC 水，如 Sigma、Amresco 等；

3. RNAzap（Ambion RNaseZap® RNase Decontamination Solution）；

4. 无 RNase 的解剖剪、镊子、刀片（可用酒精棉擦净后锡纸包好，180℃ 烘箱 4 小时进行处理）；

5. 液氮 3L； 

6. 干冰 10-15kg（也可取样液氮冷冻后放置在 -80℃ 冰箱，样本寄送时再订购干冰）；

7. 商品化无 RNase 的离心管，如 Eppendorf、Extragene 等；

8. 一次性口罩，一次性手套，橡胶手套，锡箔纸，超纯水，酒精棉，无纺布，自封袋。

实验前处理：

1. 实验前用酒精棉擦拭工作台面（实验不需要在超净工作台中操作）；

2. 锡箔纸铺台面，用酒精棉擦拭锡箔纸，后续操作在锡箔纸铺的台面上进行；

3. 将所有用到的锡箔纸表面、镊子、解剖剪、刀片用无水乙醇擦一遍，再用无纺布蘸 RNAzap 擦一遍；

4. 实验全程佩戴一次性口罩；

5. 实验全程佩戴橡胶手套，并勤换手套。

实验操作：

1. 烧杯倒入50ml DEPC水（DEPC水要勤换，每取一个生物学样本换一次）

2. 取植物活体特定组织样本，在有 DEPC 水的烧杯中涮干净表面（动作一定要快，几秒内完成），放入无 RNase 离心管中，拧紧盖子，放入液氮中冷冻 10min，取出离心管放入自封袋，并放入 -80℃ 冰箱等待寄送。

注意事项：

（1）采集根系部位前要稍作清理，避免带入泥沙、培养基、无机盐、苔藓等，否则会影响抽提质量或引入外源污染。

（2）采集叶片组织，特别是来自野外的叶片，要注意叶片背部是否有虫卵寄生，避免引入外源污染。

（3）实验过程中，烧杯内壁、解剖剪、镊子、刀片勤用 RNAzap 擦，离心管和自封袋用前做好标记，所有操作动作一定要快。

（4）液氮可倒在冰盒里，将装好样本的离心管放入冰盒中速冻。

（5）从样本提取到送样，最好不要超过 3 个月。

（6）送样前切忌反复冻融。

（7）植物组织不要使用 RNAlater 保存，因为植物组织含有细胞壁及次生壁，RNAlater 不易渗透入组织内部；也勿用 Trizol 直接浸泡植物组织。

（8）请不要将植物组织磨成粉寄送，尽量送完整的组织。

 

第八节 全基因组甲基化测序样品准备流程

1、动植物组织 

（1）植物组织：建议取新鲜幼嫩的叶片组织，每份样本 2g 左右，装入2ml离心管中，液氮速冻15min，标记好样品名称和日期，-80°C保存，干冰运输，建议送 2-3 份样本。不接收失绿或衰老严重组织样本。

（2）动物组织：建议取肌肉组织，每份鲜重 2g 左右，装入 2ml 离心管，液氮速冻 15min，标记好样品名称和日期，-80°C 保存，干冰运输，建议送 2-3份样本。不建议无水乙醇保存过久的组织作为提取样本。

2、昆虫 

（1）中大型昆虫（体长 5mm，体宽 3mm 以上）建议取肌肉组织（避开昆虫肠道，以避免肠道微生物的污染，或整只昆虫直接放入离心管内），每份样本 2-3g，液氮速冻 15min，放入 2ml 离心管内，标记好样品名称和日期，-80°C 保存，干冰运输，建议送 2-3 份样本。不建议无水乙醇保存过久的昆虫作为提取样本。

（2）微体型昆虫（蚜虫、飞虱类等） 建议取活昆虫（如蚜虫，20 只以上，3g 左右），放入 2ml 离心管，并标记样品名称和日期，液氮速冻 15min ，-80°C 保存，干冰运输，建议送 2-3 份样本。不建议无水乙醇保存过久的昆虫作为提取样本。

动物组织及昆虫样本若条件仅允许无水乙醇保存，则参照以下方法：

（1）初期处理。将刚取的组织放入 1.5ml 或 2ml 离心管中，加入远大于组织体积的无水乙醇进行固定（情况允许下，建议20倍组织体积的无水乙醇）。

（2）勤换乙醇。初期无水乙醇的更换频率应在每 12-24 h 更换一次（甚至更加频繁），之后可三天或一星期更换一次至浸泡液澄清透明，无异色。此后不在更换，期间，若发现浸泡液呈现淡黄色，则应立即更换无水乙醇，因为此时为其分泌腺体破裂，极易导致 DNA 的降解。

（3）保存运输。无水乙醇固定保存的组织昆虫等，放 -20°C 或 -80°C 保存。

3、血液样本 

采集新鲜血液 1-3ml 于抗凝管中（推荐使用 BCT 管或者 EDTA 抗凝管，由于会影响提取效果，不能使用肝素抗凝），标记好样品名称和日期，颠倒摇晃几次，封口处用封口膜密封，保存在 -20°C 冰箱，冰袋运输，建议送 2-3份样本。

4、核酸样本 

（1）主带清晰，无杂质；

（2）样本体积不少于 10μl；

（3）全基因组甲基化文库：50ng/μl，2.5μg；

（4）微量全基因组甲基化文库：5ng/μl，50ng。

 

第九节 RNA 核酸样本要求 

1．RNA：体积 >15μl，浓度、总量依文库类型来定（RNA 质检判定标准表），请将 RNA 务必装于无 RNase 的 1.5ml 离心管中，为避免后续因转移样品造成损失，不接收使用 200μl（PCR 管）管、0.5ml 离心管承载的 RNA 样品。

2．需经过 DNase I 处理，保证无 DNA 残留。 

3．RNA 完整度：无降解，建议保存不超过 3 个月，琼脂糖凝胶电泳 28s 和 18s 条带清晰，RIN 值要求根据文库类型不同来判定。

4．物化状态正常：肉眼判断样品应为无色、透明、纯净无杂质不粘稠，无荧光染料的液体。

5．避免紫外，不可反复冻融，不可存放于高温状态，不可存放于极端PH 溶液中（PH<6 或 PH>9）。

 

3、蛋白质组测序样本准备流程

（1）动物组织样本

样本类型	样本量	样本处理及保存
常规动物组织 （比如肝，肾脏， 脑组织等）	200mg-2g	1.尽量使用 Eppendorf 等进口品牌离心管或冻存管。 2. 取材新鲜组织，4℃ 预冷 PBS 快速清洗组织残留 血液，将组织块在盛有液氮的锡纸槽中速冻后，再 装入液氮预冷的螺口冻存管中，将螺口盖子旋紧并 做好标识。 3. 样品采集完成后，迅速进行液氮速冻 5min 以上， 之后可转移至 -80℃ 冰箱冻存，避免反复冻融。
软体动物	200mg-2g	PBS 洗涤去除污染物，迅速液氮速冻5min 以上，保存至-80℃，避免反复冻融。
动物坚韧组织 - 软骨	400mg-2g	1.尽量使用 Eppendorf 等进口品牌离心管或冻存管。 2.取材新鲜组织，4℃ 预冷 PBS 快速清洗组织附着血清和其他液体，用手术刀片切成边长0.5cm 小块或 100-200mg 左右小块，迅速液氮速冻 5min 以上， 保存至 -80℃，避免反复冻融。
动物坚韧组织 - 毛发	100mg-2g	PBS 洗涤去除污染物，迅速液氮速冻5min 以上，保存至-80℃，避免反复冻融。

 

（2）植物组织样本

样本类型	样本量	样本处理及保存
鲜嫩组织	500mg-2g	1. 尽量使用 Eppendorf 等进口品牌离心管或冻存管或者采用干净的锡箔纸。 2. 相同类型的样品：选取的部位要一致，去除非目标组织，如研究果肉，在低温环境中去掉果皮和种子等。 3. 取材新鲜组织，尽可能的去掉发生衰老、病变、感染霉菌或者附着其他物质部分，保存样品的一致性。（地上部分可以在样品离体前用水洗掉杂质，水分吹干后，再采集样品。地下部分可以在样品离体后，用 4℃ 预冷的 PBS 清洗污染物，用无尘纸吸干。）迅速装入液氮预冷的螺口离心管中，将螺口盖子旋紧，在液氮速冻 5min 以上。或者放入在干净的液氮速冻过的锡箔纸 上，锡箔纸的内、外壁均要明确标示样品名称，在外重新包新的内、外壁均要明确标示样品名称的干净锡箔纸，在液氮速冻 5min 以上。-80℃ 冰箱保存。
果实，种子	1g-2g
木本植物根， 树皮，枝条等	3g-10g
花粉	200-400mg	植物开花期收集花粉，在显微镜下检查花粉，用解剖 针去除杂质，转入进口 EP 管内，保存于 - 80℃。
藻类组织	800mg-2g	根据不同的藻类采取合适的离心力，分离藻类同时保 证细胞完整，如1000g 离心 15min， 去上清，PBS 洗 涤三次，去掉 PBS，取沉淀，分装到多个2ml 的离心管，液氮速冻，保存至 -80℃。

 

（3）微生物样本

样本类型	样本量	样本处理及保存
菌类	100-300μL 纯菌类	1. 采用离心或其他方法分离菌和培养基，避免培养基蛋白对菌的污染。 2. 收集菌至 15ml 离心管中。弃上清后，用10ml 4℃ 预冷 PBS（或其他符合要求的缓冲液）溶液洗三遍。 3. 用 1ml 4℃ 预冷 1×PBS 重悬菌，转移1.5ml 离心管中，离心，用枪头吸掉上清，记录菌体积。将样品分装到多个 1.5ml 管，每管装 50μL。每个样品至少 2-3 管。液氮速冻后，-80℃ 冰箱保存。

 

（4）细胞样本

样本类型	样本量	样本处理及保存
悬浮培养细胞	2×105- 107 个细胞	1. 悬浮细胞培养至细胞浓度为 2×105 -107 /ml。 2. 400-1000g 离心 5-10 分钟收集细胞至 15ml 离心管中。弃上清后，用 10ml 4℃ 预冷 PBS 溶液洗三遍。 3. 用 1ml 4℃ 预冷 1×PBS 重悬细胞，转移至 1.5ml 离心管中，400-1000g 离心 5-10 分钟，弃上清，残留液体不超过 10μL，每管细胞体积保持在 50μL 左右，记录细胞体积。细胞液氮速冻后，-80℃ 冰箱保存。
贴壁细胞	2×105- 107 个细胞	1. 细胞在合适的培养基中培养至覆盖培养皿 70-90% 面积。 2. 去掉培养基后，每个培养皿用 10ml 4℃ 预冷 PBS 溶液洗三遍。将培养皿倒扣过来，将残留的液体控干。此时可以将培养皿-80℃冻存，准备寄样，建议至少做到该步骤。以下步骤建议您最好在自己试验室完成。 3. 将控干的培养皿放在冰上，10cm 的培养皿中可加入预冷的0.5ml蛋白裂解液（裂解液技术部可提供）。轻轻摇晃细胞培养皿。保持培养皿在冰上，用细胞刮将细胞刮下，吸取细胞和裂解液到 1.5ml 离心管。（此时可以将离心管 -80℃ 冻存，准备寄样）。 4. 混匀，沸水浴 3min。 5. 20℃，14000 rpm 离心 15 分钟。上清转移至新的离心管。-80℃冰箱保存，准备寄样。

 

（5）液体样本

样本类型	样本量	样本处理及保存
血浆	200μL	1. 采集血液样本，建议使用 BD EDTA 血常规管（含抗凝剂）。 2. 轻轻地 180 度上下颠倒混匀，持续 8-10 次，以混匀血液和添 加剂。 3. 立即 4℃，≤1300g（根据物种稍微进行调整）离心 10min。 4. 用移液器将血浆转移到进口 EP 离心管中。液氮速冻后，-80℃ 冰箱保存。
血清	200μL	1. 收集全血至真空采血管（如 BD vacutainer 公司的红头真空采 血管）。血清管应被轻轻地 180 ℃ 上下颠倒混匀，持续 5-6 次。 2. 4℃ 放置 30- 45min, 4 ℃，≤1300g（根据物种稍微进行调整） 离心 10min。 3. 用移液器将血清转移到进口 EP 离心管中，液氮速冻后，-80℃ 冰箱保存。
尿液	5ml	1. 收集不添加稳定剂的尿液样本，样本立即 4℃，1000g/min 离 心 10~15min，去掉细胞和碎片，收集上清液。 2. 4℃，15000g 离心 10 分钟，去掉沉淀颗粒。上清转移至新的 离心管。用进口离心管分装，样品用液氮或干冰速冻，储存于 - 80℃。
唾液	0.3ml- 5ml	禁食两小时以上，9:00-12:00 am取样，1000g-2000g 离心5min，（或使0.22μm滤膜过滤），取上清，用进口品牌离心管分装， 0.1~1ml×3管，-80℃ 保存。
泪液	30uL- 200uL	收集样品（可利用 capillary micropipette 或 Schirmer strip）于进 口品牌离心管，8000-14000g 4度离心 5min，取上清到0.5ml 离心管内，-80℃ 保存。
细胞培养上清液	50- 100ml	1. 细胞在合适的培养基中培养至覆盖培养皿 70-90% 面积。 2.去掉培养基后，用无血清培养基清洗三遍。加入无血清培养基， 生长一定时间后，收集无血清培养上清于进口离心管中。 3.1000g 离心 10 分钟去掉细胞，取上清，上清 12000g 左右高速 离心去掉细胞碎片和沉淀，取上清分装到多个进口离心管中，-80℃ 冻存。

 

（6）其他样本

样本类型	样本量	样本处理及保存
SDS-PAGE 胶条	肉眼可见条带 ×2	1.SDS-PAGE 胶的要求：PAGE 胶为 1.5mm 厚度，用 10孔的梳子或15孔梳子，上样体积不超过20μL。如果样品体积过大，请将样品浓缩后，再加 loading buffer 进行样品变性。 2. 电泳上样要求：如果样品数量大于等于两个，两个样品之间请加一个空白泳道，避免样品交叉污染。这个空白泳道可以上 20μL 的 loading buffer。 3. 染色要求：电泳完后用 R250 染色。请不要使用 G250染色，后期脱色不干净，易产生污染。银染使用与质谱兼容的方法。 4. 切胶注意事项和要求：佩戴无粉丁腈手套。将凝胶清晰拍照，每块胶有一个编号，每个泳道注明样品名称，切胶位置用箭头或直线指示，并标上序号。标注 Marker每条带的分子量。将胶用纯水漂洗 3 次，将胶置于干净无污染的培养皿上或其他塑料、玻璃平面，准备镊子和刀片（如果没有切胶经验，请先练习），每切一个条带，清洗刀片，避免小碎胶的污染。每个胶条的面积大小不超过 20mm2 ，如 2mm×10mm 或4mm×5mm，将切好的胶条放入 1.5ml 进口离心管中。将样品 4℃ 保存，冰袋寄送。
IP 样本	1份	方案 1：酸洗脱或蛋白质裂解液煮沸。采用酸洗脱方式， 若 wash buffer 中含有去垢剂，在 elution 之前务必用不含去垢剂的 wash buffer 洗两遍，然后再做 elution。洗脱体积不要太大。此方法后期可以溶液酶解。若后续进行label free 定量分析，推荐采用该洗脱方式处理。 方案 2：洗干净的 protein A/G-beads 中加入适量 2×SDS 上样缓冲液，沸水煮 10 分钟。此方法适合 SDS-PAGE电泳，做胶内酶解。电泳时两个样品之间请加一个空白泳道，避免样品交叉污染。如果需切取目标条带，建议跑长一点，切取目标条带到进口品牌，-80℃ 保存。如果需要切取整个泳道做鉴定，建议跑胶 1-2cm。切取所有条带到进口 EP 管中，4℃ 保存。

 

4、代谢组测序样本准备流程

样本类型	样本量	样本处理及保存
常规动物组织（比如肝，肾脏，脑组织等）	>200mg	1. 尽量使用 Eppendorf 等进口品牌离心管或冻存管。 2. 取材新鲜组织，4℃ 预冷 PBS 快速清洗组织残留血液，剥去脂肪和筋皮等结缔组织，用手术刀剪成 1cm3 小块。将组织块在盛有液氮的锡纸槽中速冻后，再装入液氮预冷的螺口冻存管中，将螺口盖子旋紧并做好标识。 3. 样品采集完成后，迅速进行液氮速冻 5min 以上，之后可转移至 -80℃ 冰箱冻存，避免反复冻融。
动物坚韧组织 - 软骨	>200mg	1. 尽量使用 Eppendorf 等进口品牌离心管或冻存管。 2. 取材新鲜组织，4℃ 预冷 PBS 快速清洗组织附着血清和其他液体，用手术刀片切成边长0.5cm 小块或100-200mg 左右小块，迅速液氮速冻 5min 以上，保存至-80℃，避免反复冻融。
动物坚韧组织 - 毛发	>20mg	用 2% SDS，50mM 磷酸钠（pH7.8）缓冲液漂洗，干燥，保存在 -80℃。
血浆	>200μL	1.采集血液样本，建议使用BD EDTA血常规管（含抗凝剂）。 2. 轻轻上下颠倒混匀，持续 8-10 次，以混匀血液和添加剂。 3. 10min 立即 。 4℃，≤1300g（根据物种稍微进行调整）离心10min。 4. 用移液器将血浆转移到进口 EP 离心管中 , 液氮速冻， -80℃ 保存。