「 技术交流 」透射电镜样本准备方法及要求
取材准备
1） 试剂：2.5%戊二醛、0.1M PH7.35 的磷酸盐缓冲液，注明配制日期及启用日期，置于4℃ 冰箱预冷（2.5%戊二醛预冷至少1小时以上；磷酸盐缓冲液不宜长时间预冷，容易结晶）。
2） 仪器与器材：锋利刀片（手术刀片或飞鹰双面刀片）、镊子、低温操作台、1.5mlEP管、培养皿（或者硬纸卡，盛戊二醛用）、注射器（植物组织用）、冷冻离心机（细菌、细胞、藻类等需要离心的样品使用）。
取材要求
1） 快
取材动作要迅速，材料离体后 1min 钟内必须进入戊二醛固定液，使组织、细胞尽可能保持原来生活状态，解剖器械要用锋利的刀片（新的手术刀片或飞鹰双面刀片）划切，避免牵拉或挤压，尽量减少取材中的机械损伤。（动物处死后 10min 内完成此步骤，时间越短越好！）
2） 准
取材要准确 ①器官要准确； ②部位要准确，如观察肾脏肾小球或脑神经元需取皮质而不要取髓质， 观察胰岛尽量取胰尾； ③胃肠道、皮肤、角膜、视网膜、耳蜗、骨骼肌等要注意方向性（横切或纵切），取材成条状（0.5mm×1mm×3mm），确保要观察的部位在较长的切面上。
3） 冷
取材过程应在 0~4℃的操作台上操作（或者是冰上操作，但要注意切勿使组织直接接触或贴近冰面，需要以操作面板隔离，以免操作时间过长而造成组织结冰出现冰晶损伤），所有器械、容器、2.5%戊二醛、PBS 需 4℃预冷足够长的时间。
4） 小
不定位组织大小为 1mm×1mm×1mm（尽可能小，可以更小为 0.5mm×0.5mm× 1mm），如肝、肺、脾等不需要看特定结构的非定位器官组织；定位组织如神经、骨骼肌、肾、脑、肠、血管、胰岛等组织取材大小为 0.5mm×1mm×3mm 的长条状。
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样本形式 |
处理方式 |
保存 |
运输 |
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组织 |
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4℃ |
冰袋 |
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细胞 |
贴壁细胞：培养好的细胞消化后收集离心，令细胞沉于管底部(沉淀约黄豆大小)，吸除上清液，立即加2mL 2.5%戊二醛固定，固定液沿细胞管壁慢慢留下，不要将细胞吹散。再转移至4°保存，冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。。 悬浮细胞：离心收集细胞，整个过程转速1000 转左右，每次时间5 分钟内，以细胞能成团为准，要肉眼可见细胞沉淀绿豆至黄豆大小，弃培养基后加电镜固定液4°保存，冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。 |
4℃ |
冰袋 |
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外秘体囊泡
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（因此类样品极易降解，样品越新鲜越好，最好数小时内完成滴片负染，否则做出的效果很不理想甚至完全观察不到） |
4℃ |
冰袋 |
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细菌悬液
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直接将细菌悬液全部转移到 15~50ml 离心管内，转速 800~1500rpm 离心 3min，随后去除大部分上清液（留 1ml 左右），将培养管里的细胞轻轻吹散后转移到 1.5ml 的 EP 管内，1500~3000rpm（视不同细胞而言，自行加大转速，建议不超过 5000rpm）离心 5~10min。离心完成后轻轻吸去出上清液，管底的细胞团不要打散，沿管壁缓缓倒入适量预冷 2.5%戊二醛，随后置于 4℃冰箱固定。 （此过程操作轻柔，切勿损伤细菌！） |
4℃ |
冰袋 |
样本储存运输标准：
1、储存：样本取材后，4 度保存时间不超过1 个月。
2、运输：样本4 度过夜后，固定液充分渗入组织中，封口膜封口，用报纸、冻存盒或者气泡膜将样本包裹。以泡沫盒+冰袋的方式快递运输。要防止样本与冰袋直接接触结冰。
注意事项：
1.请明确拍照部位及拍照倍数（一般为1000X、2000X、3000X、4000X···到10000X）。
2. 固定液用量应为10~20倍于组织块的体积。
3. 样本大小需满足上述要求。
4. 样本需完全浸泡于固定液内并防止样本贴壁固定不良。
5. 做电镜实验需提供参考文献。
附表一：戊二醛固定液配方
A、2.5﹪戊二醛固定液的配方（pH 值7.3-7.4）：
0.2M 磷酸缓冲液 50ml
25﹪戊二醛溶液（电镜专用） 10ml
加双蒸水至 100ml
