「ELISA试剂盒」大鼠白细胞介素10(高敏)定量分析酶联免疫检测试剂盒
本试剂盒仅供科研使用。用于体外定量检测大鼠血清、血浆或细胞培养上清液中的IL-1O浓度。
IL-1O简介：
大鼠白介10的cDNA编码178个氨基酸的前体蛋白，通过切割掉18个信号肽形成成熟的大鼠白介10的蛋白，大鼠白介10（IL－10）是一个多效性的细胞因子，在抑制激活的Th1细胞、NK细胞和单核/巨噬细胞产生IL-1, GM-CSF, TNF, IL-6, IL-8, IL-12和 IFN-γ等细胞因子方面起重要的作用。同时在抑制巨噬细胞细胞毒活性性和B细胞、肥大细胞和T细胞的增殖和分化方面起重要的作用。能产生IL-10的细胞很多，包括激活的Th2细胞、幼稚的胸腺细胞、单核/巨噬细胞、角化细胞、B细胞和神经胶质细胞等。
检测原理:
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中大鼠IL-10的浓度。大鼠IL-10捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的大鼠IL-10会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗大鼠IL-10抗体后，抗大鼠IL-10抗体与大鼠IL-10接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在IL-10将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，大鼠IL-10浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-10浓度。
标本收集:
1.标本的收集请按下列流程进行操作；
A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；
B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；
C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集；
D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。
2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；
3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。
4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。
注：大鼠血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。
注意事项:
1.试剂盒请保存在2～8℃。
2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。
3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。
4.底物请勿接触氧化剂和金属。
5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。
6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。
7.充分混匀对保证反应结果的准确性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。
8.室温反应，请严格控制在25～28℃。
9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。
10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。
11.加样过程中避免气泡的产生。
12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。
检测前准备工作:
1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温(25～28℃)平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。
2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。
3. 如有5×标准品稀释液用双蒸水或去离子水稀释(1份加4份水)。
4.标准品:按标签复溶体积用标准品稀释液复溶使IL-10终浓度达到500pg/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置15~20分钟后轻轻混匀（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为500pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）
洗涤方法:
自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。
实验过程需自备的材料：
1.不同规格的加样枪及相应的枪头；
2.酶标仪；
3.自动洗板机；
4.去离子水或双蒸水；
操作步骤:
1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。
2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。
3. 分别将样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入相应孔中，用封板膜封住反应孔，室温（25-28℃）孵育120分钟。对于血清血浆样本，先加50ul的样本分析缓冲液，再加50uL样本。如检测超出范围，请先加50ul的样本分析缓冲液，再加用标准品稀释液稀释后的样本50μl检测。请注意记录好样品的稀释倍数，此处加样量50ul相当于已稀释了2倍。
4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。
5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温(25～28℃)孵育60分钟。
6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。
7.加入亲和素链接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温(25～28℃)孵育20分钟。
8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。
9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温(25～28℃)孵育20分钟。
10.加入终止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。
结果判断:
1.复孔值在20%差异范围内结果有效，复孔值平均后作为测量值。
2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。
3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
灵敏度，特异性和重复性:
1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为7.4pg/ml。
2.特异性：与GDNF,GM-CSF,IFN-γ,IL-1α,IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6,PDGF-BB,TNF-α,humanIL-10,mouse IL-10等没有交叉反应。
3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.
