「ELISA」ELISA检测结果的计算

对ELISA试剂盒而言，除了常见的双抗体夹心法，还有竞争法，间接法。

不同方法由检测目标物的特点及抗体特点不同来研发的。一般说来，双抗体夹心法检测的目标是蛋白或多肽，相对比较大，有两个不同的位点被不同的抗体（捕获抗体和检测抗体）识别。

对于小分子的化合物，如固醇类激素中的雌二醇，睾酮等，因为分子较小，所以没有足够的位点来提供两个抗体识别，所以只能用竞争法。小分子的化合物，一般说来，种属特异性不强，所以试剂盒一般无种属的区分。

一、检测小分子化合物的ELISA试剂盒检测结果的计算：

用来检测小分子的竞争法ELISA试剂盒，因为检测中由待测目标物与已知浓度目标物酶结合物的与抗体竞争性结合，所以标准曲线一般由目标物和其竞争性结合物与抗体结合的比率作为纵轴来做曲线。一般来说，小分子化合物的ELISA标准曲线的绘制采用半对数或双对数法拟合曲线。

用户在做完实验后，做结果的计算时，不宜采用曲线回归后用公式计算的方法计算最终浓度。因为采用半对数拟合曲线后，曲线中涉及到自然对数的计算，使计算公式在EXCEL中不太方便输入（EXCEL熟悉自然对数公式输入除外）。最直接的方法是，采用提供的半对数座标纸，用铅笔直接标点后，连接成曲线，由曲线对应的结合率直接读出浓度。

如果只是看看做出实验的效果如何，可通过提供的标准品做曲线，看最后的回归曲线的R平方值是否接近1，越接近1，说明回归的效果越好。

具体方法如下：

1、在EXCEL上输好已知浓度标准品经实验做出的OD值及其对应的浓度值。

2、选取整列OD值（因为是结合率计算，所以0浓度一般不选择），在插入栏中，选择图表，出现图表选择框，选择散点图，一直点击下一步到形成一个图表。

3、将鼠标放在图表中非点上的任意区域，单击右键，选择图表选项栏，在网格线栏选择X轴的次要网格线，点击确定。

4、将鼠标放在X轴上，单击右键，选择座标轴格式，在刻度栏中，在上部选择栏中选择10的倍数最大值、最小值、最大刻度及相交点，在下部选择栏中选择对数刻度。

5、将鼠标放在Y轴上，单击右键，选择座标轴格式，在上部选择栏中选择最大值、最小值、最大刻度等（因为是结合率计算，所以最大值一般选择1）。

6、右单击任意点，选择添加趋势线，在类型栏中选择指数或对数，在选项栏中选择显示公式和显示R平方值，确定即可。

二、检测大分子蛋白等的ELISA试剂盒检测结果的计算：

对于大分子蛋白等待测物，常见的ELISA盒类型是双抗体夹心法，实验做完后，如何计算样本中所测目标物的浓度。实验成功与否，也可从标准曲线的角度来初步判断实验过程的操作是否成功。

做标准曲线的具体方法如下：

1、在EXCEL上输好已知浓度标准品经实验做出的OD值及其对应的浓度值。

2、选取整列OD值，在插入栏中，选择图表，出现图表选择框，选择拆线图，点击下一步，在系列栏中，分类X轴标志点击最右边图标，形成一个输入柜，选择OD值对应的浓度值，回车后点击下一步，直到形成一个图表。

3、右单击拆线任意位置，选择添加趋势线，在类型栏中选择多项式同时选择阶数，在选项栏中选择显示公式和显示R平方值，确定即可。

4、在选择阶数上，系统默认的是2次，如果曲线的R平方值偏离较多，可选择3阶多项式。

三、实验后样本中待测目标物浓度的计算：

对于机器读出的OD值后，最经典的方法就是用座标纸画出已知浓度标准品的OD值的点，连接成光滑的曲线，其中X轴是浓度，Y轴是OD值。只要通过OD值在曲线上的点就可读出其对应的浓度。但该方法需要手工作图，并且估读后，有一定的误差。

现在由于电脑的普及和运用，已可运用EXCEL表格进行回归曲线和计算了，具体方法如下：

1、在EXCEL上输好已知浓度标准品经实验做出的OD值及其对应的浓度值。

2、选取整列OD值，在插入栏中，选择图表，出现图表选择框，选择散点图，点击下一步，在系列栏中，X值输入框点击最右边图标，形成一个输入框，选择OD值所在的列，Y值输入框点击最右边图标，形成一个输入框，选择OD对应的浓度值，回车后点击下一步，直到形成一个图表。

3、右单击拆线任意位置，选择添加趋势线，在类型栏中选择多项式同时选择阶数，在选项栏中选择显示公式和显示R平方值，确定。

4、在空白处选择输入函数的“＝”后，开始输入回归得出的函数，其X值以实验得出的某一数值所在的框代替，即遇到X时，就点击实验得出的某一OD值（一般取第一行第一列的OD值），直到输入完整的函数，回车后得出的值即为该OD值对应的浓度值。选择向下拖动后，可直接完成整个实验得出所有的数值计算，比较方便。

5、本方法的核心是将OD值作为X值，浓度作为Y值，所以在选择X值和Y值时注意对应的关系。

在实际使用过程中，如果曲线回归后拟合不好，即R平方值偏离1较大，则最后计算的结果中，比较靠近曲线低值部分偏离较大，造成“计算”成负值的现象。对此，可修改拟合曲线时的阶数，尽量使曲线接近1。另一种办法是用前面提到的经典方法将靠近曲线低值部分的OD值进行估算。