慢病毒包装试剂盒

产品简介
      灵捷思生物慢病毒包装试剂盒为您的病毒包装进行一站式服务，让初学者也能快速包装优质的慢病毒（适用于HIV系统慢病毒）。

      试剂盒包含全套包装质粒、转染试剂、病毒感染增强剂及EGFP对照质粒。适用于基因过表达和干扰慢病毒的包装，以及后续稳定细胞株的构建。
      客户只需构建带有目的基因的过表达或干扰质粒，再将其和试剂盒中的包装质粒Lentiviral Mix按1：1混合，用Transfection Reagent将混合后的质粒转染293T细胞，24h就能看到荧光，48h就能收毒，利用慢病毒浓缩液能快速浓缩纯化病毒，为后续的感染实验提供高纯度高滴度的病毒。

产品组分

运输与保存方法
冰袋运输。组分均于-20℃保存。

慢病毒包装所需其他材料（自行准备或选用本公司产品）
1) HEK 293T：慢病毒包装工具细胞（cat#ZNLP-002）
2) FBS：特级胎牛血清FBS（cat#ZNLP-003）
3) 慢病毒浓缩液（5×）：cat#ZNLP-004
4) 嘌呤霉素（1mg/ml）：cat#ZNLP-005 

质粒准备
慢病毒骨架质粒构建与大提：构建含目的基因或shRNA的骨架质粒（HIV系统），并进行大提获得足够量的无内毒素质粒，且所提质粒的A260/A280在1.8～2.0之间，浓度大于0.5μg/μl。
细胞状态：选择状态良好的293T细胞进行病毒包装，尽量选择低代数细胞。

实验流程
1）293T细胞准备：转染前一天，将已经状态良好的293T细胞以合适比例接种到10cm培养皿中，当细胞长到80%左右时准备转染；
2）转染：转染前视细胞状态和密度决定是否提前换液。取两个无酶无菌的1.5ml EP管，在A、B管中先都加入500μl Opti-MEM（也可以用无血清培养基或PBS、生理盐水代替），然后再分别加入质粒和转染试剂，详细内容参考下表：

将B管转染试剂混合液加到A管中，轻轻混匀后，室温放置15min~20min后，再将AB管混合液加到细胞中，置于CO₂培养箱继续培养；
3）换液：转染12h后，小心弃掉细胞上清（注意收集上清后需要灭菌处理），然后加10ml新鲜的培养基（培养基血清浓度按细胞密度来调整，一般建议1%-5%）继续培养；
4）病毒收集：换液36-48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃保存，再重新加10ml新鲜的培养基，24h后再收集一次细胞上清于第一次的离心管中；
5）病毒处理：4℃，4000rpm离心10min收集上清液，并用用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。对病毒进行分装保存，可以直接用于下游实验。如果对病毒的滴度及纯度有较高要求，可用本公司的慢病毒浓缩液（cat#ZNLP-004）对病毒原液进行浓缩与纯化。也可以使用超滤管超滤实现病毒的浓缩；
6）病毒浓缩：使用本公司的慢病毒浓缩液（cat#ZNLP-004）进行病毒的浓缩，按病毒原液的1/4体积加入病毒浓缩液，混匀后4℃过夜（每20～30min混合一次，共进行3-5次）。第二天，4℃，4000rpm，离心 20min，吸弃上清后静置管子1～2分钟，吸走残余液体，再加入适量的PBS或培养基溶解慢病毒沉淀；超滤选择100KD大小的超滤管，4000-6000rpm，4℃离心。

7）病毒分装与保存：将病毒原液或浓缩液按合适体积进行分装，再保存于-80℃。

注意事项
1、构建稳定细胞株时，可用病毒感染增强剂和嘌呤霉素（cat#ZNLP-005）对细胞进行感染和筛选。

2、为了您的健康，实验操作过程尽量在生物安全柜中完成，并做好个人防护，请穿实验服和带一次性手套。所有实验废弃物均需要进行灭菌处理。

3、小量病毒包装时，也可以使用小提质粒。转染时如无opti-MEM，可以用PBS、生理盐水或无血清DMEM代替。