永生化细胞制备试剂盒(SV40T-EGFP-puro)

产品描述
      衰老是体外培养的哺乳动物细胞的一般特征，我们体内所有的正常细胞都配备一种自动的自我摧毁机制：在经过大约60次分裂之后，它们都会死亡。而细胞永生化是指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力的过程。目前，使用最广泛的将正常细胞永生化的方法是：通过将SV40大T抗原片段整合入靶细胞的细胞核内，使其表达来构建永生化细胞系。
      SV40（simian virus 40）是从猿猴肾细胞病毒中分离出来的，SV40病毒的细胞转化特性主要与早期蛋白T抗原有关。SV40病毒基因组早期基因编码两种肿瘤抗原(tumor antigen，T抗原)，其分子量分别为94000（大T抗原）和17000（小T抗原）。T抗原的作用是：①大T抗原为细胞转化的启动所必需；②转化细胞表型的维持必需要有大T抗原的连续表达；③小T抗原对于细胞的转化不是必需的，但可起加强作用。因此，SV40T大抗原能使细胞进入永生化的增殖状态，是常用且有效的体外细胞转化因素之一，已广泛应用于各种人类细胞类型的永生化。

      灵捷思生物为您的永生化细胞制备提供一站式服务，让初学者也能快速制备永生化细胞株。试剂盒包含SV40T慢病毒（带EGFP）、病毒感染增强剂及嘌呤霉素。

运输与保存方法
干冰运输。收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒液放置于4℃保存（一周内使用完最佳），如需长期保存请分装后放置于-80℃保存，嘌呤霉素及病毒感染增强剂于-20℃保存。
注：

1、反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此病毒在使用过程中应尽量避免反复冻融。知恩生物对慢病毒液已经进行了分装（50μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
2、若病毒储存时间超过6个月，知恩生物建议在使用前重新测定病毒滴度。

实验流程（以ZNCI-001试剂盒为例）
1) 目的细胞准备：感染前一天，将目的细胞接种到合适的细胞培养板中，当细胞汇合度约50%时准备感染；
2) 目的细胞的感染（以12孔板一个孔为例）：将孔内原有培养基弃去，将50μl慢病毒液与450μl完全培养基混合后加入孔内，感染4h后将培养基补足至1mL（感染过程中加入病毒感染增强剂，终浓度为8μg/mL）；
3) 观察感染情况：感染48~72h后，在荧光显微镜下可以开始观察到EGFP的表达；
4) 永生化细胞株的筛选：当孔内细胞生长速度明显加快后加入嘌呤霉素进行筛选，嘌呤霉素的终浓度视不同细胞而定，常规范围在2~10μg/mL。根据细胞的生长状态及荧光比例，适当调整嘌呤霉素的使用浓度，进行多轮筛选以获得生长状态优良的细胞株。对获得的永生化细胞株进行qPCR检测SV40T基因的表达；
5) 永生化细胞的保存：将筛选后的永生化细胞扩大培养，分批冻存即可；

病毒小体积感染表

注意事项
1. 构建永生化细胞株时，可先用原代细胞筛选嘌呤霉素或潮霉素的最低杀伤浓度，为后期筛选永生化细胞株做好准备。
2. 病毒的使用体积取决于细胞的易感程度，如果感染率低，可以尝试加大病毒感染体积，也可以进行多次感染，即首次感染48h后再次加病毒感染。
3. 为了您的安全，实验操作过程应在生物安全柜中完成，并做好个人防护，请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。所有实验废弃物均需要进行灭菌处理。
4. 实验完毕后请用消毒液清洗双手。